科普：牙髓间充质干细胞的分离与培养
时间：2017-07-26
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牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs) 是间充质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSC) 的一种，于牙齿内部的牙髓组织中分离出的成纤维状细胞，可自我更新及分化为硬骨、脂肪、软骨、肌肉与神经等细胞系类型。
牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs) 是间充质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSC) 的一种，于牙齿内部的牙髓组织中分离出的成纤维状细胞，可自我更新及分化为硬骨、脂肪、软骨、肌肉与神经等细胞系类型。牙齿干细胞有很多种，在牙齿所发现的各种干细胞 (stem cells)，皆有相当大的潜力，目前在牙齿已陆续发现各种不同的干细胞，包括：乳牙牙髓干细胞 (stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、恒牙牙髓干细胞 (pulp stem cells) 、未完全发育牙根尖干细胞 (stem cells from apical papilla, SCAP) 及牙周干细胞(periodontal stem cells) 等。因此，目前已有乳牙银行的产生，以保留脱落的乳牙，可分离乳牙牙髓干细胞 (DPSCs) 作为将来可能的应用，此外也在恒牙的牙髓中亦可找到干细胞并已证实具有转分化为牙本质母细胞 (odontoblasts)，促进牙本质再生(dentinogenesis) 的作用以应用于治疗龋齿。
1.将新鲜采集的牙髓，置于10 cm 培养皿中，用DPBS 清洗 3 遍，操作过程尽量避免污染。
2.接着加入5ml完全培养基(完全培养基的配置：DMEM/F12 + 20% Plus Advanced Growth Supplement (StemBo Bioscience., Ltd) + 1% L-Glutamine + 1% NEAA + 1% 双抗) 浸润牙髓组织，用无菌手术剪将其剪碎。
3. 将其剪碎组织块固定在培养皿中，于37℃、5% CO2培养箱孵育30min以使组织块黏贴在培养皿壁上。
4.接著于6 cm培养皿中加入2ml完全培养基。
5.48 h 换液，此后每 3到4天更换 1 次完全培养基。培养约 10 ~ 14 天会有细胞从组织块中爬出，细胞达到80% ~ 90%后，用胰酶-EDTA或TrypLE在 37℃消化，按1:3 比例传代。
牙髓MSC 传代与培养：
1. 吸弃培养皿中的培养基，加入适量 DPBS 轻轻冲洗1次。
2. 根据培养皿适量加入胰酶-EDTA，于37℃、5% CO2培养箱作用2~3min，用
吸管吹打培养皿底部，镜下观察细胞完全脱落后。
3. 根据胰酶-EDTA使用量加入完全培养基，与细胞混和均匀再1200×rpm离心3~5min。
4. 谨慎吸出上清，细胞团块用3ml~10ml完全培养基悬浮后，混匀细胞悬液。
5. 按照1:3~1:4的比例进行传代或按照30000~60000/ml的细胞密度将细胞接种至T25或 T75培养瓶或其它培养器皿中传代培养，放入37℃、5% CO2培养箱内培养。
6. 每2天更换一次培养基，培养2~4天，待细胞融合度达到80%左右时，参照操作步骤1~3收获细胞。
7. 细胞冻存：将细胞团块悬浮于适量 (0.5~1×106cell/ml) 牙髓MSC冻存液 (90% Plus Advanced Growth Supplement + 10% DMSO) 2~8℃冰箱放置30min，-80℃冰箱放置24h，转入液氮罐冻存。