牙髓干细胞是一类存在于恒牙／ 乳牙牙 髓内具有自我更新、多向分化、高度增殖能力的外胚 间充质干细胞，它易于获得，免疫原性低，易保存，无 伦理争议，不易形成肿瘤，较人体其他间充质干细胞 更具优势。 在适宜条件下，牙髓干细胞 可分化为多种人 体细胞，为组织器官修复和多种疾病治疗提供细胞 来源，被认为是很有前景的间充质干细胞。

牙髓干细胞的生物学性能

一、分离培养、储存与鉴定

分离牙髓干细胞 最常用的是联合酶消化法，一般从 阻生智齿、正畸减数牙、即将脱落的儒雅的牙髓组织中获取。 龋坏的 牙齿一般不作为“提牙”的细胞来源，但是用 １％聚 维酮碘处理后，再提取的 牙髓干细胞 增殖速度更快，符 合国际细胞治疗学会对间充质干细胞的三个要求， 扩大了再生医学的细胞来源。 牙库是收集直接 用于临床一线的 牙髓干细胞 的部门。 许多国家的牙库 已经建立起完善的 牙髓干细胞 存取流程，包括收集、运 输、干细胞分离、低温储藏等 。 牙髓干细胞 本质上是 一个细胞群体，它们在增殖能力、分化潜力、基因表 达和表面标记物表达方面存在着差异。 用流式分析 仪对 牙髓干细胞 进 行 鉴 定， 发 现 其 阳 性 表 达 ＣＤ７３、 ＣＤ９０、ＣＤ１０５ 等间充质干细胞特异性表面标志物， 不表达 ＣＤ３４、ＣＤ４５ 等造血干细胞标记物 。

二、多向分化

干细胞的一个突出能力是多向分化，这也是 牙髓干细胞 在组织再生中作为种子细胞的独特优势。 通 过适当的诱导，牙髓干细胞 能获得更为优越的分化效率。 无血清冻存液悬浮状态下，将 牙髓干细胞 置于－８０ ℃ 冰 箱冻存 １ 年，复苏后仍具有多向分化的能力。 将适 宜浓度氯化锂溶液加入基础培养基中，牙髓干细胞 成骨 分化明显，Ｗｎｔ ／ β⁃ｃａｔｅｎｉｎ 蛋白高表达。 在诱导液中 添加抗生素类制剂雷帕霉素，它能抑制 ｍＴＯＲ 通 路，下 调 ＥＲＫ 及 ＪＮＫ 基 因 表 达 水 平， 最 终 促 进 牙髓干细胞 成骨向分化 。 研究发现 牙髓干细胞 的染色体 端粒长度以及 ＣＤ２７１ 表达水平与其分化能力有着 密切联系。 Ｍｉｃｈｏｔ 等发现降钙素基因相关肽 会降低 牙髓干细胞 的代谢活性和增殖，但对其成骨分化 的过程不造成影响。

三、增殖和迁移

Ｇｒｏｎｔｈｏｓ 等发现 牙髓干细胞 的克隆增生率显著高 于骨髓间充质干细胞，并在传代中依然保持着较高 的增殖能力。 牙髓干细胞 增殖和迁移能力涉及众多信号 通路，有学者利用 牙髓干细胞 条件培养基培养 牙髓干细胞， 发现其迁移能力的提高是脑源性神经营养因子与受 体 ＴｒｋＢ 结合以及神经营养因子 ４ ／ ５ 与细胞迁移相 关因子 ＥＲＫ 结合的结果； Ｈｉｐｐｏ 信号通路下游转录 因子 ＴＡＺ 亦通过介导 ＴＧＦ⁃β 信号通路调节结缔组 织生长因子和富半胱氨酸生长诱导物 Ｃｙｒ６１，促进 牙髓干细胞 的增殖和迁移；胶质源性神经营养因子促进 牙髓干细胞 的迁移，涉及 ＰＩ３Ｋ／ ＡＫＴ 及 ＭＥＫ／ ＥＲＫ 信号 通道，未来将研究其是否可作为盖髓材料的辅因子； 血管内皮生长因子作用于受体，激活 ＦＡＫ／ ＰＩ３Ｋ／ ＡＫｔ 和 ｐ３８ ／ ＭＡＰＫ 通路，促进 牙髓干细胞 的迁移。 有学者将抗生素 ＭＥＴ、ＣＩＰ 分别加在纤维支架上与 溶液中，并进行细胞增殖对比，发现纤维支架状态更 有利于 牙髓干细胞 增殖。 在辛伐他汀的临床应用背 景下，有学者将其用于 牙髓干细胞 的研究，发现它能显 著促进 牙髓干细胞 的增殖，有望用于临床上牙髓切断术 后的牙髓再生。

四、代谢

与其他间充质干细胞一样，虽然 牙髓干细胞 自身代 谢较稳定，但也会受到多种因素的调控，可塑性亦很 强。 Ｄｕａｉｌｉｂｉ 等对 牙髓干细胞 进行细胞遗传学分析， 发现细胞生存环境的改变能导致细胞内染色体数量 及结构的畸变，且大部分是有益于细胞的适应性变 异。 对 牙髓干细胞 进行糖代谢分析，发现在 牙髓干细胞 分化 的早期，糖代谢不受氧压和个体差异的影响，但会从 早期未分化状态的糖酵解变成分化状态的糖酵解和 三羧酸循环同时存在。

牙髓干细胞的生物学性能及临床应用研究进展

牙髓干细胞的临床前探索

一、成骨、成牙本质

1、组织工程骨的探索

构建组织工程骨最为 重要的就是构造骨的外形和释放细胞因子的介质。 Ｔａｔｓｕｈｉｒｏ 等在单层培养基上获得 牙髓干细胞 薄片，而 后放在成骨培养基中 ３Ｄ 立体培养获得能分泌细胞 外基质和钙化基质的立体构造物，将其作为支架用 于培养 牙髓干细胞 能促进其成骨分化；Ｓｅｖａｒｉ 等用海 藻酸盐联合基质胶，再复合生物活性玻璃水凝胶作 为支架封装 牙髓干细胞 后，其成骨分化能力得到提升； Ｔｏｈ 等通过调整 ＰＥＧ⁃Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ 水凝胶的交联度和 硬度，得到人工细胞外基质，联合 牙髓干细胞 培养后促 进其成骨／ 成牙本质分化；亦有学者设计了微重力下 动态旋转培养系统，通过联合 ＰＬＡＧ 支架和经典成 骨诱导培养基，促进 牙髓干细胞 的成骨分化；Ｎａｋａｓｈｉｍａ 等获取作为支架的细胞基质，联合 ＢＭＰ⁃４ 后成功地 诱导了 牙髓干细胞 成牙本质向分化；Ｙａｎａｓｓｅ 等利用 富血小板血浆作为支架，联合 牙髓干细胞 后植入兔软骨 缺损处，兔透明软骨全层逐渐得到修复，而滑膜内层 增厚 现 象 减 少， 防 止 了 滑 膜 炎 的 发 生； Ｍａｔｏｕｇ⁃ Ｅｌｗｅｒｆｅｌｌｉ 等通过 ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ⁃１００ 对牙髓进行循 环脱细胞处理，保留了其组织特异性生长基质，联合 牙髓干细胞 培养后，牙髓牙本质复合体大量形成，给牙髓 再生的研究提供了良好的方向。 即便如此，目 前尚无具有理想代谢率的支架材料，细胞因子的释 放周期难以调控。

2、基因层次调控成骨分化的方向

 染色体上 特殊序列决定的牙本质涎磷蛋白能决定 牙髓干细胞 分 化方向，缺乏牙本质涎磷蛋白后 牙髓干细胞 会向软骨细 胞方向分化。 Ｋｉｍ 等通过基因芯片定位颅面 组织胚胎发育过程中高度表达的 ＬＩＭ ＨＯＭＥＯＢＯＸ８ 基因，发现泛素特异性蛋白酶 ＵＳＰ１ 能促进其底物 ＩＤ１ 蛋白去泛素化，而 ＵＳＰ１ 抑制剂 ＭＬ３２３ 能抑制 这个过程，促进 牙髓干细胞 的成骨分化。 转录因子 ＳＰ１ 通过调控 ＥＲＫ２ 促进底物 ＢＭＰ⁃２ 的产生，同时抑制 ＢＭＰ 靶点抑制剂的分泌型蛋白 ＮＯＧＧＩ 的作用，促 进 牙髓干细胞 的成骨分化。 如何在基因层面进行精 准调控则是未来需要聚焦的重大课题。

3、宏观理化因素对成骨分化的影响

理化因 素作为诱导因子也扮演着重要角色：低分子量鱼精 蛋白－超氧化物歧化酶能穿透 牙髓干细胞 的细胞膜，抑 制过氧化氢对细胞的氧化应激损害，促进其成骨向 分化；低强度激光预处理 牙髓干细胞 促进其成骨分 化，机制尚不明确；Ｏｌｉｖｅｉｒａ 等［３２］ 用适宜直流电 刺激 牙髓干细胞，促进了 牙髓干细胞 的成骨／ 成牙本质分化， 极大地提高了组织工程骨的构建效果；适宜浓度的 锶亦可促进 牙髓干细胞 的成骨／ 成牙本质分化。 但 是应该更多地从宏观变化来探讨其具体成骨机制， 为未来的宏观精准调控奠定基础。

二、成肌／ 成血管

自 Ｇｒｏｎｔｈｏｓ 等发现 牙髓干细胞 以来，成肌分化亦成 为研究热点。 有学者利用 ５⁃Ａｚａ⁃２⁃脱氧胞苷抑制 牙髓干细胞 中 ｍｉＲＮＡ⁃１３５ 以及 ｍｉＲＮＡ⁃１４３ 表达，成功促 进了 牙髓干细胞 向肌细胞的分化［。 亦有学者利用 ｍｉＲＮＡ⁃１２６ 转染人乳牙 牙髓干细胞（早期外胚叶间充质 组织头部的神经嵴细胞迁移生出的牙髓间充质干细 胞），发现其血管样结构、ＣＤ３１、血管内皮生长因子 Ｒ２、血管生成素⁃１ 均显著增加。 用含血管内皮 生长因子的培养基诱导人乳牙 牙髓干细胞 成血管分化， 出现血管样结构，血管内皮细胞表面标记物免疫荧 光呈阳性。 Ｓｕｇｉｙａｍａ 等栓塞小鼠大脑中动脉 制备短暂性局灶性脑缺血再灌注模型，ＣＤ３１ 阴性 和 ＣＤ１４６ 阴性的牙髓干细胞侧群（ ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ， ＳＰ）细胞植入的低血区有大量的小鼠内皮细胞抗原 表达，他们认为，ＳＰ 细胞可促进内皮前体细胞的迁 移和分化，诱导低血区血管发生。

三、神经再生

Ａｈｍｅｄ 等认为 牙髓干细胞 分泌的一些细胞因子 对逆转阿尔茨海默病起着关键性作用，它们能刺激 内源性存活因子 Ｂｃｌ⁃２，降低凋亡调节因子 Ｂａｘ。 有 人用 ３⁃乙 酰 吡 啶 诱 导 大 鼠 小 脑 共 济 失 调 模 型， 牙髓干细胞 移植入相应区域后分化为神经胶质细胞和神 经元，体视学见小脑分子层、颗粒层和白质体积明显 增加，炎症细胞因子水平下降，浦肯野细胞的退化也 被遏制。 有学者利用内皮细胞和星形胶质细胞 共培养建立血脑屏障模型研究脑卒中治疗方法，他 们向血管注射 牙髓干细胞 后，增强了血脑屏障的通透 性，促进了干细胞的粘附和迁移，对中风治疗产生积 极影响 。 Ｓｏｗａ 等利用腺病毒载体转染形成过 表达肝细胞生长因子的 牙髓干细胞，促进脑缺血－再灌 注后的血管生成，延长了急性脑卒中治疗的窗口期。常规治疗脊髓损伤的方法会形成胶质瘢痕，Ｆｅｉｔｏｓａ 等构建了狗的慢性脊髓损伤模型，他们用未成熟 的 牙髓干细胞 移植到脊髓损伤区域后，狗的肢体功能得 到明显的改善。 Ｇｎａｎａｓｅｇａｒａｎ 等探究在体外炎 症微环境中 牙髓干细胞 对神经元和小胶质细胞的影响， 为帕金森病治疗寻找替代方法，未来可能成为个性 化细胞替代疗法的关键一步。

四、糖尿病

Ｄａｔｔａ 等用链脲佐菌素建立大鼠糖尿病神经 病变模型，他们将 牙髓干细胞 经肌肉重复注射后，大鼠 痛觉过敏症状、握力、运动协调性和神经传导速度均 有所改善，未来还需要对其脂肪代谢、胰岛再生等方 面进一步研究。 Ｍａｋｉｎｏ 等认为移植细胞很少能 在移植部位存活，他们在大鼠后肢骨骼肌注射浓缩 １０ 倍的 牙髓干细胞 条件培养基后，增加了巨噬细胞中抗 炎标志性因子 ＣＤ２０６ 和 ＩＬ⁃１０ 的表达，诱导了 Ｍ２ 极化，延长了背跟神经节细胞的突起生长，增加了施 万细胞的增殖和髓鞘形成，糖尿病多发性神经病变 得到恢复，作为治疗糖尿病多发性神经病变的一种 无细胞治疗策略，未来还需要进一步研究其注射的 剂量、治疗时间和疗效持续时间。 Ｋａｎａｄａ 等探 究 牙髓干细胞 及 牙髓干细胞 分泌因子对糖尿病多发性神经 病变的影响，发现发挥作用的还是细胞的分泌物。

五、眼角膜

眼 角膜移植手术给因角膜致盲的患者带来曙光， 但存在角膜供体短缺、移植物长期保存困难以及移 植物排斥反应和伦理冲突等问题。 牙髓干细胞 因其与角 膜组织共同来源于胚胎外胚层的神经嵴，具有分化 为角膜各层组织细胞的潜力，成为研究的热点。 体 外培养的 牙髓干细胞 能够表达与角膜缘干细胞相同的 分子标记物。 未分化的 牙髓干细胞 亦能够表达角膜上 皮细胞特异性标志物细胞角蛋白。 羊膜组织和软性 角膜接触镜作为角膜重建中的生物载体以及 牙髓干细胞 能够明显改善受损角膜的透明度进而防止角膜上皮 结膜化的研究已深入；以人类未成熟 牙髓干细胞 结合作 为生物支架的去上皮羊膜，通过特殊的诱导方式进 行培养能重建眼表；牙髓干细胞 亦能通过恢复视网膜色 素上皮细胞和光感受器细胞治疗视网膜退行性疾 病。 长期的效果还需要更丰富的临床实践进 一步验证。

牙髓干细胞的临床应用进展

一、牙髓再生

再生移植体植入根管前需要一个相对无菌且洁 净的环境，有学者利用 １ ｍｇ ／ ｍＬ 抗生素 ＤＡＰ 对根 管进行消毒处理后，再用 ＥＤＴＡ 进行清洗，基本消除 了残留的 ＤＡＰ 对根管产生的影响，牙髓干细胞 的增殖和 附着得到明显提高，这可能归因于 ＥＤＴＡ 有能力洗 去牙本质中残留的 ＤＡＰ，并暴露各种牙本质基质成 分和生长因子。 牙髓再生研究的焦点集中于可 注射支架，利用支架搭载种子细胞和微环境则可以 实现这个过程。 典型的可注射聚 Ｌ⁃乳酸微球支架 和自组装纳米纤维海绵微球支架等，它们的特性包 括：高表面积和纳米纤维结构有利于细胞与材料的 相互作用；在体内降解的过程是可控的、渐进的、缓 慢的，能模拟细胞外基质相互连通的纤维多孔结构； 能够搭载 牙髓干细胞 进入不规则的根管，使移植体尽可 能充满整个根管。 通过低氧 ３Ｄ 培养复合物，转录 因子 ＨＩＦ⁃１ 表达上调，后者促进血管内皮生长因子 生成，移植后组织血管密度与天然牙髓组织结构一 样，且牙本质－牙髓界面出现特征性的成牙本质细 胞内衬。 在高仿生体内模型中注射聚 Ｌ－乳酸微球 支架－牙髓干细胞 复合物后，根管内大量表达Ⅰ型胶原 和牙本质形成蛋白，促进了牙本质再生，此技术有望 替代惰性根管充填材料，促进有效的牙髓－牙本质 复合体再生，使根管治疗长期的效果更佳。

二、神经再生

常规药物大都通过血液循环进入大脑，这在急 性期似乎是可行的，但慢性期完整血脑屏障的存在 则使其疗效难以达到满意的效果。 学者们另辟蹊 径，选择颅内注射 牙髓干细胞。 由于慢性期可能出现神 经替代、血管生成和神经可塑性现象，他们利用老年 人自体适宜浓度的 牙髓干细胞，采用特殊的方式注射．牙髓干细胞的生物学性能及临床应用研究进展 中度至重度残疾的中风幸存者脑部梗死灶及其周 围，通过术前及术后多次观察分析得出结论：自体 牙髓干细胞 治疗中风后慢性症状是安全的、可行的。 也有 牙髓干细胞 分化为神经前体细胞，再将其与提供微 环境和神经营养因子的片状蜗螺旋神经节共培养后 移植改善感音性耳聋的报道等。

三、骨再生

组织工程骨是通过种子细胞、生物支架、细胞因 子三者联合植入骨缺损处，用于取缔自体或同种异 体骨移植的一种骨再生的方法。 近年来，国内外有 许多将组织工程骨成功用于临床骨缺损的报道，目 前处于比较前沿的是：机械解聚牙髓获得富含干细 胞的自体微型移植物，后者与胶原支架结合后用于 骨再生。 机械解聚能在很小的自体牙髓样本中产生 数百万个微型移植物，５０ μｍ 滤网过滤后，通过衰老 分化细胞的排出和年轻干细胞的富集，获得的细胞 与酶消化后的细胞完全相似，整体移植用于牙周围 骨组织再生，避免了收集牙髓和分离间充质干细胞 的过程，术后临床和影像学效果显著。 有学者收 集了扩增培养的 牙髓干细胞，联合胶原基质支架植于下 颌智齿拔牙窝，再生的骨血管分布均匀，骨密度和牙 槽间隔显著提高， 有效减少了拔牙后牙槽骨的 吸收。

四、其他

自 ２０２０ 年初新型冠状病毒疫情爆发以来，领域 内学者在已有的 牙髓干细胞 研究成果的基础上，开展了 异体 牙髓干细胞 用于治疗重症 ＣＯＶＩＤ⁃１９ 的临床试验， 在小样本量下，对实验组和对照组分别进行安全性 和有效性的对比评估，各项临床指标试验结果有统 计学意义，展示了其在应对突发性临床及公共卫生 事件中的巨大优势。 国内在王松灵院士团队的 引领下，有关 牙髓干细胞 的研发专利层出不穷，涉及医 疗多个前沿领域：牙髓干细胞 用于治疗或预防神经性疾 病、风湿性疾病、肥胖症和／ 或代谢综合征的研究正 在不断深入；体外诱导 牙髓干细胞 向膀胱平滑肌细胞、 心肌样细胞分化的方法也获得了一大批专利成果； 牙齿相关干细胞、基因修饰的牙源性干细胞的用途 也在临床上不断拓展；在支架开发方面，有促进骨缺 损修复的埃洛石复合水凝胶的合成以及基于蛋清和 甲基丙烯酸衍生化聚合物的复合膜制备，更是拓展 了它们在培养干细胞方面的应用； ＴＮＦ⁃α 等增强 牙髓干细胞 与脐静脉内皮细胞共培养的血管生成能力也 予以转化应用；基于 牙髓干细胞 对皮肤成纤维细胞衰老 及增殖能力的影响，一种高保湿促润肤的重建儿童 乳牙 牙髓干细胞 面膜有望进入市场用于人体；亦有学者 开发了 牙髓干细胞 延缓女性卵巢早衰的技术等等。